▶ 服务介绍

       免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是基于抗原-抗体特异性结合原理的亲和纯化技术，广泛用于从细胞或组织裂解物中富集、分离天然靶蛋白。其核心流程包括样品制备、抗体孵育、复合物捕获、洗涤及洗脱分析，可延伸为Co-IP（免疫共沉淀）用于检测蛋白相互作用，或结合ChIP（染色质免疫沉淀）研究蛋白质与DNA的结合。

▶ 实验步骤

一、样品制备与预处理

• 细胞裂解：需使用低浓度去垢剂（如RIPA裂解液）避免干扰抗原-抗体结合，单管IP推荐初始裂解物体积0.2-0.4 mL（含1-3 mg总蛋白），并添加1.5-2倍常规用量的蛋白酶抑制剂。总蛋白浓度可通过Bradford或BCA法测定。
• 预处理步骤：富含IgG的样品需用Protein A/G琼脂糖珠（30 μL/1-3 mg蛋白）4℃旋转孵育60分钟，500g离心1分钟去除非特异性结合杂质。

二、免疫沉淀核心步骤

1. 抗体孵育：取200-400 μL预处理裂解物，加入1-4 μg特异性抗体及孵育液，4℃旋转孵育2-4小时或过夜；同时设置同型IgG对照组排除非特异性结合。
2. 复合物捕获：加入50 μL Protein A/G珠子，4℃孵育1-4小时后离心弃上清，用含蛋白酶抑制剂的1×TBST洗涤4-5次，每次500g离心30秒。
3. 洗脱与检测：加入20 μL 5×SDS上样缓冲液，95-100℃煮沸5分钟，离心后取上清进行SDS-PAGE及WB分析。WB检测时建议使用HRP-抗兔轻链二抗或HRP-Protein A以减少抗体重链干扰。