▶ 服务介绍

       酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录调控机制的深入认识，其核心原理是利用转录激活因子的组件式结构特性探测蛋白质之间的相互作用。真核生物的转录激活因子（如酵母GAL4蛋白）通常由两个功能独立的结构域组成：DNA结合结构域（DNA-BD）：负责识别并结合靶基因上游的特定DNA序列（如GAL4的上游激活序列UAS）。转录激活结构域（AD）：通过与转录 machinery 其他成分结合，启动下游基因的转录。这两个结构域单独存在时无法激活转录，但当它们通过蛋白质相互作用在空间上接近时，可重建完整的转录因子活性，从而激活报告基因的表达。

▶ 实验流程

一、载体构建-获取目的基因
       通过PCR等方法从相应的DNA模板中扩增出编码待研究蛋白质的基因序列。

二、构建诱饵载体
       将目的基因克隆到含有酵母转录因子DNA结合结构域（BD）的载体上，构建成诱饵载体。

三、构建猎物载体
       将可能与诱饵蛋白相互作用的蛋白质的基因克隆到含有酵母转录因子激活结构域（AD）的载体上，得到猎物载体。

四、酵母菌株的选择与准备
      1、选择合适的酵母菌株：根据实验需求选择合适的酵母菌株，常见的有Y2HGold等菌株。
      2、酵母感受态细胞的制备：采用化学方法或电转化法将酵母细胞制备成感受态细胞，以便于后续的载体转化。
      3、转化酵母细胞-共转化：将构建好的诱饵载体和猎物载体同时转化到酵母感受态细胞中。
      4、筛选阳性转化子：利用载体上携带的筛选标记，如营养缺陷型标记，在相应的筛选培养基上筛选出同时含有诱饵载体和猎物载体的阳性转化子。

五、相互作用检测
      1、报告基因检测：如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生相互作用，会使酵母转录因子的BD和AD结构域相互靠近，从而激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达情况，如β-半乳糖苷酶活性、荧光素酶活性等，来判断蛋白质之间是否发生相互作用。
      2、酵母表型分析：有些报告基因的表达会导致酵母细胞在特定培养基上出现生长或颜色变化等表型，通过观察酵母细胞的表型来判断蛋白质相互作用。

六、结果验证
      1、重复实验：为确保结果的可靠性，需要进行多次重复实验。
      2、其他实验验证：采用其他技术如免疫共沉淀、GST-pull down等实验进一步验证蛋白质之间的相互作用。